[Preprocessing] Quantile Normalization

Quantile Normalization 방법은 생물정보학에서 자주 사용되는 Microarray를 표준화하는 방법 중 하나이다.

이번 포스팅에서는 Quantile Normalization을 수행하는 방법과 R로 간단히 코드를 작성해보려고한다.

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1. DNA Microarray 란?

 

DNA Microarray란 흔히 DNA칩 혹은 바이오칩으로 알려져있으며, 고체 표면위에 매우 작은 DNA 조각들을 부착해 놓은 것을 말한다.

실험 대상의 유전자를 DNA 칩과 결합시켰을 때, 각 유전자들의 발현량을 수치화하여 자료를 얻게 되고 그 자료를 분석하여 병의 원인이나 이상 유전자등을 찾는데 사용된다. 

Sample Image of Microarray - Wikipedia

이러한 Microarray data는 짧은 시간 내에 대량의 자료를 얻을 수 있다는 큰 장점이 있지만, 그만큼 다양한 형태의 오차를 포함하게 되는 단점이 존재한다.

따라서, 생물학적 차이를 제외한 다른 오차들을 제거하는 과정이 Microarray data를 분석할 때 가장 중요하다.

 

Microarray data의 전처리(preprocessing) 단계는 크게 3 단계로 나눌 수 있다.

1) Background correction : Detecting and Handling Noise
2) Normalization : Making each sample (Microarray) distribution identical in statistical properties.
3) Summarization : Combining the multiple preprocessed probe intensities to a single expression value.

(여기서 probe란 하나의 DNA sequence라고는 한다. 아직, 용어나 이론적인 background는 부족해서 공부가 더 필요할 듯!)

 

이번 포스팅에서는 전처리 단계 중 Normalization에 해당하는 Quantile Normalization에 대해서 알아보고자 한다.

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2. Quantile Normalization

 

Quantile Normalization은 기준 분포(reference distribution)가 있을 때와 없을 때 적용하는 방법이 약간 다르다.

 

분포를 동일하게 만들고 싶은 기준 분포가 있을 경우는 아주 간단하다.

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1. Test data에 수집된 유전자 발현량 자료가 있을 때, 각 샘플 별 rank를 구한 rank table을 만든다. 
2. Reference distribtion의 값을 sorting한다.
3. 1에서 구한 rank table에 맞춰, 각 rank에 해당하는 reference distribution의 값으로 대체한다.

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이해하기 쉽게 그림으로 살펴보면 다음과 같다.

Quantile Normalization with Reference distribution

 

기준 분포가 없을 때 Quantile Normalization을 하는 방법은 다음과 같다.

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1. 주어진 Test data에서 각 sample별로 rank를 구한 뒤 Rank table을 만든다.
2. 주어진 Test data에서 각 sample별 값을 sort하여 Sort table을 만든다.
3. Sort table을 사용하여, 각 rank 별 평균 값을 구한다.
4. 1에서 만난 Rank table을 3에서 구한 rank별 평균 값으로 대체한다.

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이해를 위해 그림을 살펴보면 다음과 같다.

 

Quantile Normalization without reference distribution

위 그림에서 나타낸 Test data를 사용하여 R로 간단하게 Quantile Normalization하는 방법을 살펴보겠다.

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3. R code

 

q = matrix(data = c(11,8,5,7,10,
                    6,10,9,4,5,
                    8,2,6,7,3), byrow=F,nrow=5,ncol=3)
colnames(q)<-c("S1","S2","S3")

> q
     S1 S2 S3
[1,] 11  6  8
[2,]  8 10  2
[3,]  5  9  6
[4,]  7  4  7
[5,] 10  5  3

## Create Rank Table
qr<-apply(q,MARGIN = 2,rank)

## Create Sort Table
qs<-apply(q,MARGIN = 2,sort)

# Compute mean for same rank
qm<-apply(qs,1,mean) # Return vector, first value corresponding to rank 1

norm.q<-matrix(qm[as.vector(qr)],ncol=ncol(q),nrow=nrow(q))

qn=matrix(nrow=nrow(q),ncol=ncol(q))

for ( i in 1:length(qr)){
  r = qr[i]
  qn[i]=qm[r]
}
colnames(qn)<-colnames(q)

## Normalizing Result
> qn
           S1       S2       S3
[1,] 9.666667 6.666667 9.666667
[2,] 6.666667 9.666667 3.666667
[3,] 3.666667 8.666667 6.666667
[4,] 5.000000 3.666667 8.666667
[5,] 8.666667 5.000000 5.000000

 

Normalization 결과를 그래프로 살펴보면 다음과 같다.

 

Before Normalization

After Normalization

 

3개의 샘플이 모두 동일한 분포를 갖게 된 것을 알 수 있다.

 

4. Normalization의 이유?

 

내가 처음 Quantile Normalization에 대해서 배웠을 때, 나는 가장 먼저 다음과 같은 생각이 들었다.

 

" 이렇게 기존 값들을 다 대체해버리면, 기존 값이 가지고 있는 의미가 다 퇴색되고 뭉게질텐데 정보의 손실이 너무 크지않나?"

 

하지만, Microarray 같은 경우는 샘플마다 검출 효율이 다르고, 두 검체 간 RNA 양이 다를 수도 있고, 빛에 의한 민감성, 스캐닝 상태 등등 다양한 이유로 수치화 된 발현량 값 자체는 많은 의미를 갖지않다고 한다.

 

예를 들어, A라는 유전자가 S1에서는 12, S2에서는 2만큼 발현되었다고 생각해보자.

수치만 보면 A라는 유전자는 S1에서 훨씬 크게 발현되었다고 생각할 수 있다.

 

하지만, S1에서는 12가 가장 작은 발현량이고, S2에서는 2가 가장 큰 발현량이라면? 

A라는 유전자의 발현량 차이를 12와 2 숫자만 가지고 비교하는 것은 잘못된 접근 방법이다.

 

우리의 목표는 "A라는 유전자가 S2보다 S1에서 10만큼 더 발현했다"가 아닌, "S1과 달리 S2에서는 A라는 유전자가 가장 많이 발현했다" 이기 때문에, 수치적인 비교를 기반으로 하는 통계 방법을 적용하기 위해서는 Normalization이 필수적이다.

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참고

• https://en.wikipedia.org/wiki/Microarray_analysis_techniques
• https://en.wikipedia.org/wiki/Quantile_normalization
• https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
• Kim, S. (2001). Microarray 를 이용한 유전자 발현 연구. 대한임상미생물학회지: 제, 4(2).